scanpy_extractGenes.py는 Scanpy를 이용한 전처리 및 정규화 과정 후, 분석에 사용되는 전체 유전자 목록을 추출하는 프로그램입니다. 이 스크립트는 특히 topGO 분석과 같은 하위 집합 기반 유전자 기능 분석에 필요한 입력 파일을 준비하는 과정에서 사용됩니다. 사용자는 먼저 scanpy_normalize를 통해 정규화된 AnnData 객체를 준비하고, 이를 기반으로 본 프로그램을 실행하여 전체 유전자의 리스트를 추출합니다. 추출된 유전자 리스트는 각 유전자에 대한 식별자 정보와 함께 CSV 또는 텍스트 파일 형태로 저장되며, 이후 topGO의 입력값으로 활용할 수 있습니다.

scanpy_subsetAnnData는 특정 그룹 내 특정 카테고리의 세포들에 대해 raw UMI count matrix를 분리하고, 새로운 AnnData로 저장합니다. Subset 후 Normalization과 Scaling을 다시 수행하려면 원본 데이터(raw matrix)를 사용해야 합니다. 이미 가공된 데이터를 기반으로 subset을 수행하면, 기존 통계 정보가 남아 있어 새로운 subset에 적합하지 않은 결과가 나올 수 있습니다. 따라서 adata_qc_passed_concat.h5ad에 있는 가공되지 않은 원본 데이터로 subset을 수행해야 정확한 분석이 가능합니다. 이 프로그램은 특정 세포 유형(예: T 세포)이나 조건별 하위 집단만 별도로 분석하고자 할 때 사용되며, 원하는 subset을 추출한 뒤 해당 데이터에 맞추어 정규화, 스케일링을 포함한 후속 분석 전 과정을 다시 수행할 수 있습니다.

TopGO는 특정 유전자 목록을 기반으로 Gene Ontology(GO) 용어의 풍부도를 분석하는 R 패키지입니다. 이를 통해 차이가 있거나 관심 있는 유전자들이 GO의 어떤 기능 범주(Biological Process, Molecular Function, Cellular Component)에 과도하게 포함되어 있는지를 통계적으로 평가할 수 있습니다. GO의 계층 구조를 고려하여 부모-자식 노드 간 의존성을 반영한 보다 정확한 enrichment 분석이 가능하며, Fisher’s exact test, Kolmogorov-Smirnov test, weighted scoring 등 다양한 통계적 방법을 지원합니다.

scanpy_plotCellTypeProportion 함수는 AnnData 객체 내 두 개의 범주형 변수(예: 클러스터와 세포 유형)를 기반으로 교차 빈도표(contingency table)를 생성합니다. 이를 통해 첫 번째 그룹의 각 카테고리(예: 세포유형)에 속한 세포들이 두 번째 그룹(예: 클러스터)의 각 카테고리에 얼마나 포함되는지 계산할 수 있습니다. 계산된 값은 절대 빈도(absolute counts)와 상대 점유율(relative proportions)로 제공되며, 이를 막대그래프로 시각화하여 각 클러스터에서 어떤 세포 유형이 어느 정도 분포하는지 직관적으로 확인할 수 있습니다.

scanpy_plotGeneExprs 함수는 사용자가 지정한 유전자 발현을 scatter plot, dot plot, violin plot, 혹은 heatmap 형태로 시각화하는 기능을 제공합니다. 이 함수는 DEG(차등 발현 유전자)를 계산하지 않으며, 사용자가 직접 지정한 유전자 목록이나 사전에 수행된 DEG 분석 결과를 기반으로 발현 양상을 시각화합니다. 출력된 그래프는 자동으로 파일로 저장되며, 연구자는 이를 통해 각 세포 집단 간 발현 패턴을 직관적으로 비교하고 해석할 수 있습니다. 이러한 시각화는 후속 분석이나 결과 보고에 매우 유용하게 활용됩니다.

분석에 사용되는 AnnData 객체를 기반으로, 각 클러스터(그룹) 내 세포와 나머지 세포 간, 혹은 사용자가 지정한 두 클러스터(그룹) 간의 차별 발현 유전자(Differentially Expressed Gene, DEG)를 선별합니다. 이는 두 세포 집단의 유전자 발현량 차이를 Scanpy의 scanpy.tl.rank_genes_groups() 함수에 내장된 t-test, Wilcoxon rank sum test 등의 통계 기법으로 비교하여 수행됩니다. 결과 파일에서는 두 집단 간 발현 차이를 보이는 유전자 목록을 확인할 수 있으며, 이를 시각화하여 활용할 수 있습니다.

CellTypist는 단일세포 전사체 데이터에서 세포 유형을 자동으로 예측하고 주석을 달아주는 Python 기반 패키지입니다. 미리 학습된 reference 모델(예: Immune_All_Low, Immune_All_High, Lung_Immune, Brain_NonImmune, PBMC 등)을 활용하여 각 세포의 발현 패턴을 비교·분류합니다. 사용자는 AnnData 객체를 입력해 간단히 실행할 수 있으며, 결과는 각 세포별 세포 유형 정보로 추가됩니다. 직관적이고 빠른 분류가 가능해 대규모 단일세포 데이터 분석에 유용하며, 연구자의 해석을 보완하는 도구로 널리 활용됩니다.

Scanpy에서는 연구자가 특정 마커 유전자의 발현 패턴을 기준으로 직접 클러스터에 세포 유형을 부여할 수 있습니다. 예를 들어 T세포 마커(CD3D, CD3E), B세포 마커(MS4A1), 대식세포 마커(LYZ) 등의 발현을 확인하여 해당 클러스터가 어떤 세포 집단인지 판단합니다. 이후 클러스터 번호(예: 0, 1, 2…)에 연구자가 정의한 세포 유형 라벨을 매핑해 adata.obs['celltype'] 같은 새로운 열에 저장할 수 있습니다. 이 방법은 자동 주석 도구 대비 해석자의 전문 지식을 반영할 수 있어, 데이터 특성에 맞는 맞춤형 주석 작업이 가능하다는 장점이 있습니다.

scRNA-seq 데이터는 기술적 요인(technical factors)의 영향을 받아 샘플 간 실제 생물학적 변이를 가릴 수 있으며, 이로 인해 연구 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 대표적인 기술적 요인 중 하나인 batch effect는 샘플이 서로 다른 그룹이나 배치에서 처리될 때 발생할 수 있습니다. 이러한 영향을 최소화하기 위해 샘플을 동일한 날짜에 처리하고, 동일한 프로토콜과 장비를 사용하는 방법이 권장됩니다. 또한 batch effect correction을 위한 다양한 기법과 패키지(Harmony, MNN, ComBat 등)가 개발되어 있으며, Bio-Express에서는 Scanpy에 탑재된 BBKNN을 활용하여 batch effect correction 기능을 제공합니다. Batch correction 이후 scanpy_findNeighbors부터 scanpy_scatterPlot까지의 과정을 다시 수행해야 하며, 이를 통해 보정된 데이터 기반의 군집화 및 시각화 결과를 확인할 수 있습니다.

앞서 계산된 UMAP, t-SNE, 혹은 PCA 임베딩 결과를 활용하여 모든 세포에 대한 산점도를 시각화합니다. 이때 각 점은 하나의 세포를 나타내며, 샘플 정보나 findClusters 단계에서 얻은 클러스터 번호에 따라 색상 또는 모양으로 구분할 수 있습니다. 이러한 산점도는 군집 구조 확인을 넘어, 개별 세포 수준에서 특정 유전자의 발현 패턴을 탐색하는 데도 유용합니다. 예를 들어, raw count, log-normalized, scaled 등 다양한 데이터 변환 방식에 따른 발현 강도를 색상으로 표시하면 특정 유전자가 집단 특이적으로 발현되는지, 혹은 전반적으로 균일하게 분포하는지를 효과적으로 파악할 수 있습니다.

scanpy_findClusters 단계는 앞서 계산된 scRNA-seq 데이터의 neighbor graph(FindNeighbors 단계 결과)를 기반으로, 각 세포를 유사한 발현 패턴을 가진 그룹으로 묶는 클러스터링 과정을 수행합니다. 이때 Leiden 또는 Louvain 알고리즘을 사용하여 세포 집단을 자동으로 식별하며, 알고리즘은 세포 간 연결 강도와 구조를 고려하여 최적의 군집을 형성합니다. 클러스터 번호는 세포 수가 많은 그룹부터 0, 1, 2… 순으로 할당되며, 결과는 AnnData 객체의 obs에 저장되어 추후 시각화, 차원 축소(UMAP/t-SNE), 또는 집단 간 차이 분석에 활용할 수 있습니다. 이 과정은 scRNA-seq 데이터에서 세포 유형 및 상태를 탐색하는 핵심 단계입니다.

runUMAP은 앞서 계산한 scRNA-seq 데이터의 neighborhood graph를 기반으로, 비선형 차원 축소 기법인 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection)을 수행합니다. 이 과정은 고차원 유전자 발현 데이터를 저차원 공간으로 변환하면서, 데이터의 전반적인 구조와 세포 간 관계를 최대한 유지하도록 설계되었습니다. UMAP을 통해 얻은 임베딩은 각 세포의 위치 정보를 2차원 또는 3차원 공간에 나타낼 수 있으며, 이를 바탕으로 클러스터링, 시각화, 군집 간 관계 분석 등에 활용할 수 있습니다. 경우에 따라, UMAP 대신 scanpy_runTSNE 단계를 사용하여 국지적 구조를 강조한 비선형 임베딩을 수행할 수도 있습니다.

scanpy_runTSNE는 scRNA-seq 데이터에 대해, UMAP 등장 이전에 사용하던 비선형적 차원 축소 방식인 t-stochastic neighbor embedding(t-SNE)를 수행합니다. t-SNE는 고차원 공간에서 각 점과 그 이웃 간의 거리를 보존하는 저차원 공간을 찾습니다. 이를 통해 데이터의 국지적인 구조를 유지함으로써, 복잡한 집단에서 많은 서로 다른 클러스터를 2차원상에서 분리되도록 embedding합니다. 때에 따라 scanpy_runUMAP 단계로 대체할 수 있습니다. (UMAP은 전반적인 데이터의 구조를 유지하지만, t-SNE는 국지 구조만을 유지한다는 단점을 가집니다.)

findNeighbors는 scRNA-seq 발현량 데이터를 기반으로 세포 간 유사성을 평가하여 neighbor graph를 구축하는 과정입니다. 각 세포는 유전자 발현 패턴이 비슷한 이웃 세포들과 연결되며, edge에는 발현 패턴의 유사도에 따라 가중치가 부여됩니다. 이를 통해 각 세포에 대해 유사도가 높은 세포들을 효율적으로 선별할 수 있으며, 생성된 neighbor graph는 후속 군집 분석(clustering), 차원 축소(UMAP, t-SNE) 및 다양한 downstream 분석에서 세포 간 구조를 반영하는 기초 자료로 활용됩니다.

scanpy_runPCA는 고차원 유전자 발현 데이터를 저차원으로 축소해 주요 패턴을 추출하는 과정입니다. scRNA-seq 데이터는 차원이 높고 노이즈가 많기 때문에, PCA(Principal Component Analysis, 주성분 분석)를 통해 변동성이 큰 방향을 찾아 요약합니다. 주로 HVG(Highly Variable Genes)를 기반으로 수행하여 생물학적으로 의미 있는 변동성을 반영합니다. 이렇게 얻은 주성분은 데이터의 구조를 유지하면서 계산 효율성을 높이고, 이후 클러스터링이나 시각화(UMAP, t-SNE) 같은 분석의 기초로 활용됩니다.

Log-normalization을 마친 AnnData 객체의 발현량을 바탕으로, 전체 세포 집단에서 각 유전자의 발현량을 Z-score 방식으로 표준화(z-scaling)합니다. 이 과정을 통해 유전자 간 발현량의 차이를 정규화하여, 특정 유전자가 PCA, UMAP, 클러스터링과 같은 downstream 분석에서 지나치게 큰 영향을 미치는 것을 방지합니다. 또한, 모든 유전자의 발현값이 동일한 척도로 변환됨으로써 분석 결과가 보다 공정하고 안정적으로 산출되며, 데이터의 변동성이 높은 유전자가 과도하게 결과에 영향을 주는 것을 막아 차원 축소 및 클러스터링 결과의 신뢰도를 높이는 데 기여합니다. 이 표준화된 데이터는 이후 분석에 최적화된 형태로 활용됩니다.

단일 세포 발현 매트릭스는 수많은 세포와 유전자를 포함하기 때문에 매우 높은 차원을 가지며, 직접적인 분석은 계산량이 크고 해석이 어려울 수 있습니다. 이를 완화하기 위해, 전체 세포 집단에서 세포 간 발현 차이를 잘 설명할 수 있는 highly variable gene (HVG)를 선별하여 데이터 차원을 감소시키는 것이 일반적입니다. scanpy_findHVG는 log-normalized expression matrix를 기반으로, 각 유전자의 평균 발현량 대비 분산이 높은 유전자들을 HVG로 선정합니다. 선정된 HVG는 downstream 분석에서 주로 사용되며, 결과물로는 HVG가 포함된 AnnData 객체, HVG 리스트, 그리고 mean-dispersion plot이 제공됩니다.

세포의 유형이나 크기에 따라 세포당 총 RNA 수는 크게 달라질 수 있으며, 이러한 차이는 scRNA-seq 데이터 분석에서 발현량 편향이나 downstream 분석 오류를 유발할 수 있습니다. 이러한 문제를 보정하기 위해 Bio-Express에서는 Scanpy에서 제공하는 count depth scaling 방법을 사용하여 각 세포의 총 UMI 수를 기준으로 발현량을 조정합니다. 모든 발현량 조정이 끝난 후에는 각 값에 1을 더하고 자연로그(log1p)를 취하여 발현량 분포의 왜도(skewness)를 완화하고, 극단값에 의한 영향을 줄입니다. 변환된 데이터는 AnnData 객체의 기본 위치(X) 또는 사용자가 지정한 layer에 저장되며, 이후 normalization이 필요한 분석 단계에서 그대로 활용할 수 있습니다. 이를 통해 서로 다른 세포 간의 발현량 비교를 보다 정확하게 수행할 수 있습니다.

Scanpy applyQCthreshold는 QC 지표가 계산된 AnnData object(.h5ad 파일)를 불러와 사용자가 지정한 QC 범위에 따라 세포를 필터링합니다. 이 과정에서는 총 UMI 수, 세포별 발현 유전자 수, 미토콘드리아 유전자 비율 등을 기준으로 낮은 품질의 세포를 제거할 수 있습니다. 필터링된 세포는 샘플별 개별 AnnData로 저장하거나 모든 샘플을 통합한 AnnData로 저장할 수 있습니다. 임계값 적용 이후 각 샘플의 QC 지표(n_genes_by_counts, total_counts, pct_counts_mt) 분포는 히스토그램과 산점도 플롯으로 시각화되며, 이를 통해 사용자는 지정한 QC 기준이 적절하게 low-quality 세포를 제거하고, 고품질 세포를 유지했는지 직관적으로 검토할 수 있어 이후 분석의 신뢰성을 높일 수 있습니다.

DropletUtils의 filterCells는 sample_info.csv 파일을 불러온 뒤, 해당 파일에 기재된 각 샘플에 대해 비어 있는 droplet을 제거합니다. 구체적으로는 다음 절차를 거쳐 수행됩니다. 먼저, cellranger count의 산출물 중 filtering되지 않은 feature-barcode count matrix를 불러오고, 이 과정에서 각 droplet에 sample_info.csv에서 얻은 샘플 정보를 매핑하여 저장합니다. 이후 각 droplet의 총 UMI 수를 계산하여 기본값으로 100 이하인 경우를 비어 있는 droplet으로 간주합니다. 이러한 기준을 바탕으로 전체 droplet 중 실제로 empty droplet일 것으로 추정되는 경우를 선별하고, 반대로 비어 있지 않은 droplet은 실제 세포로 판단합니다. 실제 세포로 구분된 droplet의 count matrix는 추후 분석에 활용할 수 있도록 입력과 동일한 .mtx 형식으로 저장합니다. 또한 filtering되지 않은 전체 droplet을 대상으로 barcode rank plot을 작성하여 제거된 droplet의 UMI 분포와 rank 정보를 시각적으로 확인할 수 있습니다.

Cellranger count 단계는 Cell Ranger의 count 서브커맨드를 이용하여 단일 scRNA 샘플(single sample)에 대해 read alignment, barcode 및 UMI 처리, 유전자 발현 정량화, 품질 지표 생성 등 전체 분석 과정을 자동으로 수행합니다. 이 과정은 10X Chromium 플랫폼에서 제작된 scRNA-seq 라이브러리로부터 생성된 FASTQ 파일을 입력으로 받아, gene-by-cell expression matrix를 산출합니다. 또한 각 샘플의 메타데이터를 표 형식으로 저장하여 후속 분석에 활용할 수 있습니다.

Cell Ranger는 10x Genomics 사의 single-cell library preparation kit로 제작된 scRNA-seq 라이브러리에서 생성된 FASTQ 파일을 처리하는 소프트웨어입니다. 후술할 cellranger count 단계에서는 read alignment를 수행하고 feature-by-barcode 기반의 UMI(unique molecular identifier) count matrix를 생성합니다. 이를 위해서는 reference genome (FASTA)과 gene annotation (GTF) 파일이 필요하며, 이 파일들을 Cell Ranger가 읽을 수 있도록 전용 형식으로 미리 변환되어야 합니다. 이 작업은 cellranger mkref 단계에서 수행됩니다. Bio-Express에는 GRCh38 (Homo sapiens) version 44와 GRCm39 (Mus musculus) version M33에 대한 reference가 이미 내장되어 있으므로, 해당 reference를 사용할 경우 runCellRanger_mkref 단계를 생략할 수 있습니다.